Jumat, 20 Januari 2012

AKLIMATISASI


PEMBUATAN MEDIA


PEMBUATAN MEDIA

1.        Pengertian Media
Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan.  Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon.  Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan lain-lain.  Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan. 
2.        Komponen-komponen Media dan Kegunaannya
Media tanam kultur jaringan terdiri dari sejumlah unsur yang  diperlukan untuk pertumbuhan eksplan dalam lingkungan buatan, unsusr-unsur ini umumnya tedapat di tanah.  Komponen media kultur jaringan dapat dikelompokkan kedalam berikut ini.     
a.         Unsur makro,  terdiri dari unsur-unsur: nitrogen (N), fosfor (P), kalium(K), kalsium(Ca), magnesium(Mg), dan sulfur(S)
b.         Unsur mikro, terdiri dari: boron(B), cobalt(Co), tembaga (Cu), Iodium(I),  besi(Fe), mangan(Mn), molybdenum(Mo), dan seng(Zn)
c.         Vitamin (vitamin B1) dan Myo-inositol, pada beberapa formula media terkenal juga menambahkan niasin dan piridoksin (B6)
d.         Gula (sukrosa), sebagai sumber energi
e.         Zat pengatur tumbuh, untuk merangsang dan mengontrol pertumbuhan
f.          Agar, sebagai pemadat media
g.         Arang aktif, sebagai penyerap senyawa racun (jika diperlukan)
h.         Air(aquades), sebagai pelarut
3.        Formulasi Media
Terdapat banyak formula media tanam kultur jaringan yang pada umumnya diberi nama sesuai dengan nama penemunya, antara lain:
a.     Murashige  dan  Skoog (MS),  memiliki  kisaran  pemakaian  yang paling luas
b.    Gamborg atau B-5, cocok untuk kultur suspensi sel kedelai dan legum
c.     Vacin Went (VW), digunakan untuk media anggrek
d.    Nitsch dan Nitsch, digunakan untuk kultur tepung sari dan kultur sel
e.     Schenk dan Hildebrandt (SH) digunakan untuk media tanam dikotil
f.     Woody plant Plant Medium (WPM) digunakan untuk media tanaman berkayu

Tabel 1.  Komposisi bahan kimia pada beberapa formulasi media (mg/l)
Unsur makro
VW
SH
MS
B-5
WPM
Nitsch
KNO3
80
2500
1900
2500
-
950
NH4NO3
-
-
1650
-
400
-
(NH4)2 SO4
-
-
-
134
-
-
NH4H2PO4
-
300
-
-
-
-
CaCl2 2H2O
-
151
332,2
150
96
166
Ca(NO3)24H2O
285
-
-
-
556
-
KCl
65
-
-
-
-
-
KH2 PO4
-
-
170
-
170
68
MgSO47H2O
740
400
370
250
370
185
Na2SO4
200
-
-
-
-
-
NaH2PO4 H2O
16,5
-
-
130,5
-
-
Unsure Mikro
MnSO4.4H2O
7
13,2
16,9
10
29,4
25
ZnSO4.7H2O
2,67
1
8,6
2
8,6
10
H3BO3
1,5
5
6,2
3
6,2
10
KI
0,75
0,1
0,83
0,75
-
-
CuSO4 5H2O
0,01
0,2
0,025
0,025
0,25
0,025
NaMoO3
0,001
-
-
-
-
-
NaMoO4.2H2O
-
0,1
0,25
0,25
0,25
0,25
CoCl2 6H2O
-
0,1
0,025
0,025
-
-
FeSO4 7H2O
-
15
27,8
27,8
27,8
27,8
Fe2(SO4)3
2,5
-
-
-
-
-
Na2 EDTA
-
20,1
37,3
37,3
37,3
37,3
Vitamin
Mio-inositol
-
1000
100
100
100
100
Tiamin HCl
0,1
5
0,1
10
0,1
0,5
Piridoksin HCl
0,1
0,5
0,5
0,1
0,5
0,5
Asam nicotin
0,5
5
0,5
1
0,5
5
Glisin
3
-
2
-
2
2
Biotin
-
-
-
-
-
0,2
















 Sumber; Sutter EG dalam trigiano, RN dan DJ gray (1996)

4.               Menentukan pH larutan media
Tingkat keasamaan larutan media juga menentukan keberhasilan dalam perbanyakan secara kultur jaringan. pH yang dibutuhkan tanaman berkisar antara 5,6 - 5,8. Pengukuran pH dilakukan dengan menggunakan pH meter, atau bila menginginkan yang lebih praktis dan murah dapat digunakan kertas pH (kertas lakmus). Akan tetapi pengg unaan kertas lakmus kurang akurat dibandingkan dengan penggunaan pH meter. Apabila pH larutan media dibawah ketentuan di atas maka perlu ditambahkan NAOH 1-2 tetes sedangkan apabila pH larutan media di atas ketentuan maka perlu ditambahkan HCl 1-2 tetes. Media yang mempunyai pH asam atau basa sangat mempengaruhi pertumbuhan tanaman di dalamnya. Keadaan media yang terlalu asam akan membuat media menjadi tidak padat, sehingga tanaman tidak akan dapat berdiri dengan tegak dan tidak dapat menyerap nutrisi secara optimal. Sedangkan media yang terlalu basa akan membuat tanaman yang tumbuh di dalamnya menjadi keriting atau bahkan mati. Oleh karena itu pengukuran pH perlu diperhatikan, Untuk menjaga keseimbangan larutan media.
Manfaat pH dalam media tanam adalah untuk :
·                Menjaga kestabilan membrane sel dan sitoplasma
·                Membantu penyerapan unsur hara
·                Mengatur sifat padat  pada agar (dalam media padat)

5.             Alur pembuatan media











Flowchart: Alternate Process: Penimbangan Gula dan Agar
Flowchart: Alternate Process: Pemipetan Larutan Stok



Flowchart: Alternate Process: Pengukuran ph larutan media
Flowchart: Alternate Process: Penambahan Aquades Hingga Volume Tertentu











Flowchart: Alternate Process: pemasakan dan penambahan 
gula serta agar pada larutan media


Flowchart: Alternate Process: penuangan media pada botol kultur

 

               
                     









Flowchart: Alternate Process: Labelisasi Dan Inkubasi Media



Flowchart: Alternate Process: Penutupan Botol



Flowchart: Alternate Process: Sterilisasi Media
Flowchart: Alternate Process: Media Siap Pakai




6.                  Menentukan Jenis Dan Komponen Larutan Stok
Sebelum melakukan kegiatan pembuatan media, perlu dilaksanakan pembuatan larutan stok. Larutan stok adalah larutan yang konsentrasinya dipekatkan atau ditinggikan dari konsentrasi dalam media.  Biasanya dinyatakan dalam kelipatan konsentrasi media, misalnya 10x, 20x, 100x, bahkan 1000x konsentrasi media. Tujuan pembuatan larutan stok adalah untuk menghindari penimbangan yang berulang-ulang setiap kali membuat media.  Disamping itu, kadang-kadang timbangan untuk menimbang bahan-bahan dalam jumlah yang sangat kecil tidak tersedia di laboratorium. Pembuatan larutan stok didasarkan pada pengelompokan-pengelompokan yaitu: stok makro, stok mikro, stok Fe (besi), stok vitamin dan stok hormon. Stok hormon dapat disimpan antara 2- 4 minggu, sedangkan hara dapat disimpan 4 – 8 minggu.  Dengan adanya larutan stok, pembuatan media selanjutnya tinggal mengencerkan larutan stok saja.
7.                  Menghitung Kebutuhan Larutan Stok
Tabel 1. Konsentrasi Bahan/Larutan Stok Pada Media MS (mg/l) dan Volume Pengambilan Sok untuk Bahan Pembuatan Media
No.
Bahan/Stok
Pemekatan
MS (mg/l)
Konsentrasi stok (mg/l)
Vol. stok
diambil
1.       
Stok Makro
NH4NO3
KNO3
CaCl2.2H20
KH2PO4
MgSO4.7H2O

10x
10x
10x
10x
10x

1.650
1.900
440
170
370

16.500
19.000
 4.400
1.700
3.700

100 ml
100 ml
100 ml
100 ml
100 ml
2.       
Stok mikro
H3Bo3
Na2MoO4.7H2O
CoCl2.6H2O
KI
MnSO4
ZnSO4.7H2O
CuSO4.5H2O


100x
100x
100x
100x
100x
100x
100x

6,2
0,25
0,025
0,83
16,9
8,6
0,025

620
25
2,5
83
1.690
860
2,5

1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
3.       
Stok Fe EDTA
FeSO4.7H2O
Na2EDTA

10x
10x

27,8
37,3

278
373

100 ml
100 ml
4.       
Stok Vitamin
Tiamin-HCl,
Piridoksin-HCl
Asam nikotinat
Glisin

10x
10x
10x
10x

0,1
0,5
0,5
2,0

1
5
5
20

100 ml
100 ml
100 ml
100 ml
5.       
Stok Mio
Mio-inositol
10x
100
1.000
100 ml
6.       
Stok Hormon
ZPT (BA, NAA)

100 ppm

ses.kbt

100

7.       
Sukrosa
Agar-agar

30.000
±8.000
Tdk dibuat stok


Rumus pengambilan lar.stok


Rounded Rectangle: Vs x Cs = Vm x Cm
 


Dimana:
Vs = Volume stok yang diambil
Cs = Konsentrasi stok
Vm = Volume media yang dibuat
Cm = konsentrasi media


Contoh soal :
Berapakah pengambilan stok KNO3 yang diambil dari stok yang dipekatkan 10x,  Apabila akan membuat media 1000 ml?
Jawab :
Vs x Cs = Vm x Cm
Vs x 19.000 = 1000 x 1.900
Vs               = 1.900.000
                        19.000
                    = 100 ml

8.               Membuat larutan stok
Adapun alur pembuatan larutan stok adalah sebagai berikut :
















Rounded Rectangle: Persiapan alat dan bahan
Rounded Rectangle: Penimbangan bahan kimia sesuai formulasi



Rounded Rectangle: Penambahan aquadest steril hingga volume tertentu


Rounded Rectangle: Pelarutan bahan kimia dengan aquadest steril




Rounded Rectangle: Penghomogenan larutan di atas hot plate stirer



Rounded Rectangle: Penutupan botol




Rounded Rectangle: Larutan stok siap pakai



Rounded Rectangle: Labelisasi



Rounded Rectangle: Penyimpanan larutan stok di damalam kulkas



Pada Unsur hara makro, mikro dan vitamin dilarutkan dengan aquadest steril. Sedangkan Pada stok hormon pelarutan menggunakan NAOH, HCl atau alkohol. Hormon jenis sitokinin menggunakan pelarut HCl atau alkohol. Untuk hormon jenis auksin pelarutan menggunakan NAOH.
Teknik pembuatan stok Fe EDTA berbeda dengan pembuatan stok yang lain. Pada pembuatan stok ini dilakukan pemanasan di atas hot plate stirer.
9.                  Menyimpan larutan stok
Kondisi penyimpan larutan stok perlu diperhatikan, karena ada beberapa bahan yang tidak tahan dalam suhu tinggi atau cahaya.  Larutan stok kadang-kadang juga ditumbuhi oleh mikroorganisme, larutan stok yang terkontaminasi ini tidak dapat digunakan lagi.